虽然病毒载体能够高效地导入目的基因,并作为基因转导工具被广泛地应用,但仍存在着局限性,如病毒性载体可诱导机体产生某种程度的免疫反应,存在着插入突变等致瘤及致毒的风险,而且病毒载体的容量有限,制备滴度不高等等。而非病毒载体则具有无传染性,不限制载体容量,可大量制备及具有靶向性等优点。理想的非病毒载体需要满足以下条件:①保护DNA不被细胞外DNA降解酶的降解;②携带DNA穿透细胞膜;③保护DNA在进入细胞核之前不被细胞内溶酶体和酶等降解;④能有效将有活性的基因插入目的区;⑤可生物降解,从细胞中消除;⑥无细胞毒性。
目前应用的非病毒载体种类主要有以下几种:
一、阳离子多聚物载体:即利用阳离子多聚体,如多聚左旋赖氨酸上的正电荷与DNA上的负电荷结合发生电性中和,而形成稳定的多聚物/DNA复合物。复合物仍带正电荷,可与细胞表面带负电荷的受体结合,而被渗入至细胞内。如聚乙烯亚胺(polyethylenamine,PEI)、聚丙烯亚胺树突状物(polypropylenimine dendrimers),聚酰胺树突状物(polyamidoamine dendrimer)、多聚赖氨酸、多聚组氨酸、多聚精氨酸、鱼精蛋白、壳聚糖(chitosan)等以及上述聚合物的聚乙二醇(PEG)修饰物等等。PEI可抑制溶酶体,在吞噬泡酸性环境中质子化、正电荷增加,对DNA提供更大的保护作用,有利于质粒逃离吞噬泡。PEI糖基化或聚乙二醇化增加了其生物兼容性,阳离子多聚物/DNA混合物经PEG修饰后,可形成囊泡状结构,屏蔽表面多余的正电荷,有利于体内应用。
二、纳米颗粒载体:纳米颗粒载体介导基因转染具有其他非病毒载体所没有的优势。首先,纳米颗粒在一定范围内的颗粒数目对细胞的生长及活性无明显影响,细胞毒性和遗传毒性较其他载体低很多;同时纳米载体不存在免疫原性,因而不会导致免疫反应的发生。其次,纳米颗粒传递基因的效率较高。很多纳米材料作为载体传递基因的效率与脂质体相当甚至高于脂质体。第三,由于自身体积小,纳米颗粒可以在血管中随血液循环,并可通过血脑屏障到达身体各组织中。最后,纳米颗粒在体内的循环时间明显长于普通大小的颗粒,在短时间内不会很快被吞噬细胞清除,从而可以延长与细胞的接触时间,提高转染效率。另外,纳米颗粒还可与DNA形成致密结构,使DNA不被核酸酶消化降解,有浓缩保护DNA的作用。
目前研究较多的纳米粒主要有无机纳米粒(如磷酸钙、磁性氧化铁)、固体脂质纳米粒、可降解聚合物纳米粒(如PLA、PLGA)、天然高分子纳米粒(如壳聚糖及其衍生物)、有机硅纳米粒等。
2007年Harashima提出的基于程序组装的一种新型的复合载体系统的多功能信封式纳米载体(multifunctional envelope-type nano device,MEND)。理想的MEND是由压缩的DNA核心和含有靶向因子及功能配体的脂质信封外壳构成。首先,采用多聚阳离子如PLL、PEI将DNA压缩,以保护DNA不受核酸酶的降解,控制DNA复合物的大小及提高DNA的包封率。其次将多聚阳离子/DNA复合物通过与脂质体间的水合作用和静电相互作用包裹入脂质体中。最后对脂质体进行修饰达到不同的功能,如PEG化和靶向作用。这种新型的复合载体系统综合了各种载体系统所具有的优点,具有显著的促进基因的细胞转染潜在优势,因而有着广阔的发展前景。
三、脂质体或脂质体复合物:脂质体是由脂质双分子层组成的颗粒,可介导基因穿过细胞膜。最常用的脂质体为阳离子脂质体,如商品用lipfectin,阳离子脂质体结构一般包括疏水基团和氨基基团,增加分子中氨基基团的数目,以及增加氨基基团与疏水基团之间的距离有利于增加DNA的释放能力。主要由带正电荷的脂类及中性辅助脂类等摩尔混合而成。带阳性电荷的脂质体与带阴性电荷的DNA之间可有效地形成复合物,并通过内吞作用移入细胞内。
四、天然高分子材料:天然高分子生物材料如胶原、透明质酸、壳聚糖和海藻酸盐等被用于基因药物载体的研究。其中壳聚糖及其衍生物在基因载体系统的研究最为广泛。
五、配体介导的靶向载体:要使非病毒载体能在肿瘤细胞或特异组织中定向迁移并携带DNA进行细胞转染,就需要在载体表面进行靶向基团修饰,使其具有靶向特异性。叶酸、转铁蛋白、半乳糖、TAT肽及胆甾醇等靶向配体耦合于载体上可以提高载体的靶向性。
目前,所知的临床研究方案中,脂质体是除反转录病毒载体外应用最广泛的基因传递方法,特别在肿瘤及囊性纤维化等疾病的治疗中应用较多。尽管非病毒载体可避免引起病毒载体所带来的毒副作用,但质粒DNA和脂质体复合物与腺病毒一样,也可引发炎症。非病毒载体易于制备,并能形成规模生产,但基因转移和表达效率较低仍是困扰它发展的主要障碍。
最近研究结果表明,超声波有助于提高质粒的转移效率。超声波配合微泡回声比差剂可提高细胞膜的通透性,从而显著提高裸DNA的转移和表达效率。这项胞膜渗透技术可在细胞膜表面瞬间制造小孔,DNA则趁机进入细胞内。