（1）抗原与抗体反应：将标本（非标记抗原）、标记抗原和抗血清顺序定量加入小试管内，置室温（15～30℃）作用24h，使其充分竞争结合。　　

（2）B、F分离：分离技术多种多样，常用沉淀法。①第二抗体沉淀法：又称双抗体法，在受检抗原与第一抗体特异性反应后加入相应的第二抗体，使形成的抗原-第一抗体-第二抗体的复合物共沉，一经离心即可使结合标记抗原B与游离抗原F分离。本法是特异性沉淀，分离完全，非特异性结合力低。但第二抗体用量较大，成本较高。此外血清浓度、抗凝剂的有无因素可在一定程度上影响结果。②聚乙二醇（PEG）沉淀法：使蛋白质处于等电点状态，水化层破坏而导致蛋白质沉淀。本法优点是PEG制备方便、价廉、分离快速，缺点是非特异沉淀物较多，分离不完全。③第二抗体-聚乙二醇沉淀法：本法既有PEG法的快速沉淀优点，且保持第二抗体特异性沉淀的作用，又减少第二抗体用量，并降低PEG浓度，使非特异沉淀物减少。④活性炭吸附法：利用活性炭表面活性将小分子的游离部分吸附。如在活性炭表面涂上一层葡聚糖，使它表面具有一定孔径的网眼，从而允许小分子游离抗原或半抗原逸入而被吸附，而大分子复合物则被排斥在外。在抗原与抗体反应后，加入葡聚糖-活性炭，放置5～10min，使游离抗原吸附在活性炭颗粒上，离心使颗粒沉淀，上清液中含有结合的标记抗原。　　

（3）放射性强度测定：B和F分离后，即可测定其放射性强度。测量仪器有两类：液体闪烁计数仪（测β射线）和晶体闪烁计数仪（测γ射线）。计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为cpm（脉冲数/min）。　　每次测定均需作一标准曲线图，以标准抗原的不同浓度为横坐标，以测到的相应放射性强度为纵坐标作图。放射性强度可任选B或F，亦可采用计算值B/B＋F、B/F或B/B0。标本应作双份测定，取其平均值，在标准曲线上查出相应的受检抗原浓度