在唾液腺肿瘤中,大多数肿瘤涉及多种癌基因的激活。而肿瘤细胞的恶性表型又依赖于特定的癌基因表达。抑制癌基因及相关基因的表达将改变肿瘤的表型,终止其恶性行为。基因失活主要应用反义基因治疗,反义基因治疗策略包括三种形式:反义核酸技术、核酶和三联体DNA。
反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达,使之低表达或不表达,这种技术即为反义核酸技术,其中包括反义RNA、反义DNA和核酶(ribozymes)三大技术。
反义RNA和反义DNA
反义RNA是指能以碱基配对的形式和特定的mRNA完全互补的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段,反义DNA是指能与基因DNA双链中的有义链互补结合的短小DNA分子。反义RNA和反义DNA主要是通过mRNA的翻译和基因DNA的转录而发挥作用:①抑制翻译:反义核酸一方面通过与靶mRNA结合形成空间位阻效应,阻止核糖体与mRNA结合,另一方面其与mRNA结合后激活内源性RNase或ribozyme,降解mRNA;②抑制转录:反义DNA与基因DNA双螺旋的调控区特异结合形成DNA三聚体(triplex),或与DNA编码区结合,终止正在转录的mRNA链延长。此外,反义核酸还可抑制转录后mRNA的加工修饰,如5'端加帽、3'端加尾(poly A)、中间剪接和内部碱基甲基化等,并阻止成熟mRNA由细胞核向细胞质内运输。
反义核酸目前有三种来源:一是利用固相亚磷酰胺法人工合成的短小反义寡聚核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN),这是反义核酸最普遍的应用方式,包括未修饰AON和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化等修饰AON二类,其中以PSAON应用最广泛。AON设计合成简单,只要其顺序与靶mRNA部分顺序互补即可,而对基因的读码框无要求;二是更具有实用价值的人工表达载体,包括单个基因和多个基因的联合反义表达载体,它是利用基因重组技术将靶基因序列反向插入到载体的启动子和终止子之间,通过转录可源源不断产生反义RNA分子;三是天然存在的反义核酸分子,自然状态的反义RNA片段极不稳定,很难提纯。因此反义技术中用于肿瘤治疗的反义RNA,大多都是人工合成的核苷酸片段或构建的反义RNA表达载体。
人工合成的反义寡核苷酸可以根据基因的特异序列,构建不同种类的反义寡核苷酸,利用人工合成技术合成。反义寡核苷酸与mRNA互补序列结合,封闭特异性基因的表达,抑制从mRNA到蛋白质的翻译过程。这项实验已在动物模型研究中得到证实。有作者发现头颈部鳞状细胞癌过度表达表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR) mRNA和蛋白,而EGFR蛋白质对维持鳞状细胞癌增生是必需的。在将头颈部鳞状细胞癌异体移植到裸鼠皮下后,通过合成EGFR的反义质粒进入动物模型,反义寡核苷酸在U6RNA启动子的控制下进行表达。随后观察发现,肿瘤生长受到明显抑制,凋亡率增加。因此认为反义寡核苷酸的基因治疗途径可以干扰EGFR的表达,用于治疗EGFR过度表达的肿瘤,包括头颈部鳞状细胞癌。
反义RNA表达载体是将表达抗肿瘤基因反义RNA的基因导入肿瘤细胞中,使反义RNA能够在肿瘤细胞中与靶mRNA结合,在激活的内源性RNase的作用下,使特定的mRNA遭到分解而被消除。由于反义RNA表达载体是一种持续性的表达载体,因而在肿瘤基因治疗中受到重视。Hamada等采用人类乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV) 16的E6和E7基因的反义RNA重组腺病毒载体(Ad5CMVHPV16As)转染宫颈癌细胞,表达载体中含有巨细胞病毒启动子,具有HPV16感染的肿瘤细胞转染Ad5CMV-HPV16A5表达载体后,生长明显受到抑制。将Ad5CMV-HPV16As转染的肿瘤细胞注射到小鼠体内,不形成肿瘤。因此认为采用腺病毒反义RNA治疗宫颈癌是一种具有潜在能力的新途径。此外,现已采用K-ras癌基因的反义RNA研究肺小细胞癌的基因治疗,采用c-myc癌基因的反义RNA表达载体研究食管癌的基因治疗。在唾液腺上皮性肿瘤中,c-myc和H-ras癌基因均有突变,反义技术也为唾液腺肿瘤的基因治疗提供了一个新方法。
王旭等利用反义脱氧寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucletide,ASODN)技术,针对survivin基因设计合成的反义寡核苷酸片段,脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染ACC-M细胞,通过RT-PCR,Westernblotting检测survivin表达的改变,MTT测定细胞增殖抑制,流式细胞术测定细胞凋亡率。结果:转染ASODN组survivin表达下降,细胞凋亡率明显提高,细胞增殖明显受抑制,且与浓度有一定依赖性;ASODN组、空白组与对照组无明显差异。表明survivin ASODN能下调ACC-M细胞系中survivin的表达,在促进凋亡,抑制增殖中发挥重要作用。
核酶(ribozymes)
核酶是一种具有酶活性的RNA分子。它可特异地与靶mRNA结合并使其在特定部位断裂。由于它自身具有很高活性的催化作用,一分子核酶能与多分子的靶mRNA结合。核酶与靶mRNA结合后只催化靶mRNA断裂,自身并不被消耗,因此它反义RNA更高的效率。在肿瘤的基因治疗中,核酶发挥着重要的作用。
核酶广泛存在于生物细胞中,有锤头状和发夹二种结构。酶活性中心由两个臂和中间的功能区共三部分组成。两个臂序列高度保守,与靶RNA特异互补结合,相当于一种反义RNA,而功能区则可通过降解RNA的磷酸二酯键而分解消化靶RNA,而核酶本身在作用过程中并不消耗。核酶裂解分子依赖严格的空间结构形成,裂解部位总是位于靶RNA分子中GUX三联体(X:C、U、A)下游方向即3'端。
核酶除天然存在外,也可人工合成。根据核酶的作用位点、靶mRNA周围的序列和核酶本身高度保守序列,可方便地人工设计合成核酶的特异性序列。此外,利用基因工程将核酶的编码基因克隆在SP6或T7等启动子下游,通过转录合所需核酶。核酶能特异切割RNA分子,使阻断基因表达,特别是阻断有害基因的表达成为可能。如果已知靶mRNA中GUX三联体的位置,可将核酶的编码基因插入反义表达载体的适当位置,这样转录所产生的含有核酶的反义RNA具有双重功能:一方面具有反义抑制作用,另一方面具有切割靶mRNA的催化作用。核酶在抗肿瘤、抗病毒方面具有十分诱人的前景,第一个应用核酶进行艾滋病基因治疗的临床计划已获准,核酶作为一种遗传信息药物,在肿瘤基因治疗中必将日益受到重视。
抗c-erbB-2 mRNA的核酶具有高效的酶切活性,能够识别c-erbB-2 mRNA(Rz631) +631到+633位点中的GUC序列并能特异地催化其断裂。将抗bcl-2 mRNA的核酶转染含有c-erbB-2癌基因的卵巢癌细胞,发现该细胞生长受到明显抑制。另一项研究发现,bcl-2癌基因蛋白抑制凋亡,促进肿瘤发生。将抗bcl-2 mRNA核酶转染培养中的前列腺癌细胞株(LNCAP),转染18小时后发现被转染的LNCAP细胞株降低了bcl-2 mRNA水平和蛋白表达水平。在bcl-2低表达的LNCAP的细胞株中出现明显的凋亡现象。此外,一种抗p53核酶能剪切p53前mRNA,可以有效地降低内源性突变型p53 mRNA水平。在含有突变型p53基因的人体H226BR肺癌细胞株内,采用反转录病毒作载体,利用抗p53 RNA的核酶(RZ5a)能特异地剪切p53基因中接近第5内含子和第6外显子的187号密码子,从而降低突变型p53 RNA和蛋白水平。体外实验表明,由核酶催化剪切的是p53基因的人体细胞的生长。因此认为抗p53前mRNA,而不是p53 mRNA。核酶催化剪切的正是p53基因突变的区域,所以核酶剪切的p53前mRNA具有很高的特异性。RZ5a核酶的表达能特异性抑制H226BR细胞生长。因此认为抗p53前mRNA核酶可能在癌基因治疗中发挥作用。
三联体(triple-standed DNA)
三联体能与靶基因特异地结合,阻止RNA转录,抑制在特定位点上的基因表达。三联DNA的抑制是在转录水平上。这种抑制可用于恶性肿瘤的基因治疗,但目前尚未见报道。